Liczbę żywotnych komórek określono za pomocą wykluczenia błękitem trypanowym bezpośrednio przed (start) i cztery dni po (D4) dodaniu 5 .M PKI-166. Immunobloty rozszczepionej polimerazy poli (adenozyno-difosforanowej rybozy) (PARP) uzyskano osiem godzin po dodaniu 5 .M PKI-166. Wykres na dole po prawej stronie panelu B pokazuje, że stabilna nadekspresja PTEN (SF295-PTEN) w komórkach glioblastomy SF295 pozbawionych PTEN wzmacnia odpowiedź apoptotyczną na PKI-166. Apoptozę określono za pomocą cytometrii przepływowej (zliczono frakcję sub-G1) 24 godziny po dodaniu PKI-166. Wstawka pokazuje immunobloty dla PTEN, fosforylowane Akt i aktynę w parze izogenicznej SF295. Panel C pokazuje, że stabilna nadekspresja aktywowanego allelu Akt (A431-Akt) nie blokuje śmierci komórek wywołanej pięciodniową inkubacją z 5 .M PKI-166. Rysunek 5 Dodatkowego Dodatku (www.nejm.org) pokazuje odpowiednie immunobloty. W każdym panelu wartości plus-minus to średnie . SD. Gwiazdka oznacza przecięty produkt. Wywołaliśmy ekspresję odpowiednich kombinacji PTEN, EGFR i EGFRvIII w komórkach glioblastoma U87MG. Komórki U87MG wykazują niedobór PTEN, 35-38 wyrażają niskie poziomy EGFR typu dzikiego i brak EGFRvIII.39,40 Koekspresja EGFRvIII i PTEN w tych komórkach glejaka czyni je wysoce podatnymi na zatrzymanie wzrostu przez erlotynib w porównaniu z kontrolą komórki i komórki U87MG, które transfekowano innymi składnikami układu PTEN-EGFR (Figura 3A). W tych doświadczeniach erlotynib powodował zatrzymanie wzrostu, ale nie apoptozę w komórkach U87MG. Ponieważ komórki U87MG nie zależą od przekazywania sygnałów przez EGFR dla przeżycia, zbadaliśmy wpływ braku PTEN na trzy linie komórkowe, które ulegają apoptozie w obecności inhibitorów kinazy EGFR: komórki ludzkiego glejaka SF295, fibroblasty zarodkowe myszy myszy, u których PTEN gen został inaktywowany warunkowo, komórki 45 i A431 ze stabilnym PTEN RNAi (Figura 3B). Doświadczenia te przeprowadzono z dwoma inhibitorami kinazy EGFR, erlotynibem i PKI-166,41. We wszystkich trzech systemach brak PTEN znosił lub znacząco zmniejszał stopień apoptozy indukowanej przez dwa inhibitory kinazy EGFR (Figura 3B).
Zbadaliśmy udział Akt w oporności na inhibitory kinazy EGFR wynikające z utraty PTEN, ponieważ wiele skutków, które następują po utracie PTEN, zachodzi poprzez aktywację pobudzonej kinazy Akt.46 Wywołane erlotinibem zahamowanie fosforylacji Akt korelował z hamowaniem wzrostu w komórkach U87MG (Figura 4 Dodatku Uzupełniającego), ale nie we wszystkich liniach komórkowych. Przykładowo, w komórkach A431 eksprymujących shRNA PTEN, fosforylacja Akt była blokowana przez inhibitory kinazy EGFR (Figura 5 Dodatku Dodatku, ścieżki 3 i 4), ale komórki zachowywały żywotność (Figura 3B). Ponadto nadekspresja ukierunkowanego na błonę i stale aktywowanego allelu Akt47 (Figura 5 Dodatkowego Dodatku, ścieżki 5 i 6) nie zapobiegła apoptozie komórek A431, w których pośredniczą inhibitory kinazy EGFR (Figura 3C). Odkrycia te sugerują, że niezależne od Akt gałęzie szlaku PTEN mogą przyczyniać się do wpływu PTEN na wrażliwość guzów na inhibitory kinazy EGFR
[patrz też: ambroksol, agaricus, amiodaron ]
[podobne: symnatal pro baby, dentysta warszawa centrum, nfz olsztyn sanatoria lista oczekujących ]
