Molekularne czynniki determinujące odpowiedź glejaka na inhibitory kinazy EGFR cd

Progresję definiowano jako wzrost o co najmniej 25 procent w dwukierunkowym obszarze guza. Trzydziestu siedmiu pacjentów, 26 z wyraźnym dowodem odpowiedzi lub progresji, miało wystarczającą ilość tkanki do analizy molekularnej (Tabela i Tabela 2). Dziesięciu pacjentów zakwalifikowało się pomiędzy skrajnościami odpowiedzi na leczenie, a wzrostem lub kurczeniem się guza o 25 procent lub mniej (szczegóły podano w Tabeli Dodatkowego Dodatku, dostępnej wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie www.nejm.org). Jeden pacjent został wykluczony, ponieważ odpowiedź pojawiła się przypadkowo wraz ze wzrostem dawki dekadronu. Zastosowane metody statystyczne zostały opisane w dodatkowym dodatku. Zestaw sprawdzania poprawności
Uzyskaliśmy szkiełka zatopione w parafinie z próbek biopsyjnych złośliwego glejaka 33 pacjentów, którzy otrzymali erlotynib na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco (UCSF). Z tych pacjentów nie było dostępnej zamrożonej tkanki. Ocenę immunohistochemiczną EGFRvIII i PTEN oceniano półilościowo przez dwóch patologów UCLA, którzy nie byli świadomi wyników klinicznych.
Badania molekularne
Sekwencjonowanie DNA guza genomowego
Egzony i flankujące sekwencje intronowe dla EGFR (domeny kinazy), HER2 / neu (domeny kinazy) i PTEN (wszystkie eksony) amplifikowano za pomocą specyficznych starterów w 384-dołkowym formacie obejmującym zagnieżdżoną reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), w wykonaniu Agencourt Bioscience. Szczegóły znajdują się w dodatkowym dodatku.
Fluorescencja w hybrydyzacji in situ
Zastosowano hybrydyzację fluorescencyjną in situ z dwiema sondami (FISH) na skrawkach zatopionych w parafinie z miejscowymi sondami dla EGFR i centromerem chromosomu 7 (CEP7) (Vysis). Standardowe protokoły FISH do wstępnej obróbki, hybrydyzacji i analiz były przestrzegane zgodnie z instrukcjami producenta.20
Odwrotna transkrypcja-PCR
Do testu odwrotnej transkryptazy-PCR (RT-PCR), wysokiej jakości całkowity RNA ekstrahowano z 13 świeżo zamrożonych próbek guza (4 od pacjentów z odpowiedzią i 9 od pacjentów bez odpowiedzi). Komplementarny DNA (cDNA) został zsyntetyzowany i zamplifikowany za pomocą starterów zaprojektowanych specjalnie do amplifikacji EGFR (produkt o 1044 pz) i EGFRvIII (produkt o 243 pz). Szczegóły znajdują się w dodatkowym dodatku.
Real-Time PCR
Genomowy DNA ekstrahowano z próbek od 15 pacjentów (7 z odpowiedzią i 8 bez odpowiedzi) i poddawano PCR w czasie rzeczywistym z użyciem termocyklera iCycler (Bio-Rad Laboratories). Wszystkie pomiary wykonano trzykrotnie i potwierdzono niezależnymi eksperymentami. Dodatek ten zawiera listę użytych sekwencji starterów i zawiera pełne szczegóły.
Immunohistochemia i immunoblot
Zatopione w parafinie skrawki tkanek poddano analizie immunohistochemicznej, w której wyniki oceniano niezależnie przez dwóch patologów, którzy nie byli świadomi wyników analizy molekularnej. Wyniki 0 i uważano za wskazujące na utratę PTEN27. Jeśli wybarwianie PTEN było niejednorodne, nowotwory o zmniejszonym lub nieobecnym barwieniu w co najmniej 25 procentach odcinka uważano za niedobór PTEN. Guzy wykazujące ogniskowe, umiarkowane do mocnego barwienie immunologiczne na EGFRvIII uznano za pozytywne.27 Ilościową analizę obrazu w celu potwierdzenia oceny patologów dokonano również przy użyciu oprogramowania Soft Imaging System (pełne szczegóły podano w dodatkowym dodatku).
Modele linii komórkowych
Model U87MG
CDNA EGFR i EGFRvIII wprowadzono do komórek U87MG i U87MG-PTEN (które nadeksprymują PTEN) za pomocą wektora retrowirusowego; 1000 komórek na dołek zaszczepiono na osiem zestawów płytek 96-studzienkowych
[hasła pokrewne: polyporus, diklofenak, alemtuzumab ]
[przypisy: weterynarz mysłowice, weterynaria wrocław, weterynarz szamotuły ]