Dwadzieścia cztery godziny później dodano erlotynib w końcowych stężeniach w zakresie od 0 do 10 .M. Płytki inkubowano przez 7 do 10 dni, utrwalono, barwiono 0,25% fioletu krystalicznego w metanolu i oznaczano ilościowo. Wyniki zostały potwierdzone w kilku niezależnych klonach. Inne modele linii komórkowych
Mysie zarodkowe fibroblasty z delecją locus PTEN zostały dostarczone przez dr Hong Wu (UCLA). Linie komórkowe A431 trwale wyrażające interferencję RNA wektorowego (RNAi), krótkie RNA o strukturze spinki do włosów (shRNA) do ludzkiego PTEN (5 ATAGCTACCTGTTAAAGAA3 ) lub pWZL-MyrAkt.4-129 (dostarczone przez dr. Russella Piepera, UCSF) zostały uzyskane przez infekcję retrowirusową i wybór. ShRNAi PTEN i wektor shRNA ulegały stabilnej ekspresji w amfotropowych komórkach 293T (Orbigen). PKI-166 został dostarczony przez Novartis. Żywotność komórek określono w trzech powtórzeniach za pomocą wykluczenia błękitem trypanowym, a wyniki potwierdzono w trzech niezależnych eksperymentach. Komórki wysiewano przy gęstości 50 000 komórek na studzienkę w sześciostudzienkowych płytkach, zliczano po tym, jak komórki przylgnęły do płytki, a następnie traktowano nośnikiem lub inhibitorem kinazy EGFR. Po czterech do pięciu dni inkubacji, supernatant (zawierający pływające komórki) i adherentne komórki traktowane trypsyną połączono, wirowano przy 1500 obrotach na minutę przez 90 sekund i zawieszono w trypanowym błękicie w celu zliczenia komórek. Występowanie apoptozy potwierdzono w niezależnych eksperymentach metodą immunoblotting dla polimerazy poli (adenozyno-difosforanowej rybozy) rozszczepionej przez kaspazę (numer 9546, Cell Signaling Technology) i metodą cytometrii przepływowej.
Wyniki
Pacjenci
Tabela 3. Tabela 3. Biomarkery odpowiedzi na inhibitory kinaz EGFR. Na potrzeby tego badania wybraliśmy 7 pacjentów z jednoznacznym dowodem odpowiedzi i 19, którzy nie mieli odpowiedzi (co odzwierciedlają dowody progresji guza na MRI w ciągu ośmiu tygodni po rozpoczęciu leczenia) (ryciny 1A i 1B dodatku dodatkowego) . Mediana przeżycia po rozpoczęciu leczenia inhibitorem kinazy EGFR była istotnie dłuższa u pacjentów z odpowiedzią niż u osób bez odpowiedzi (21,7 vs. 5,8 miesięcy, p = 0,01), podobnie jak mediana czasu do progresji (9,7 vs. 1,7 miesiące, P <0,001) (Tabela i Rysunek 1C Dodatku Uzupełniającego). Nie stwierdzono istotnych korelacji między odpowiedzią a wiekiem, płcią, zakresem resekcji chirurgicznej, stanem sprawności Karnofsky ego lub dawką inhibitora EGFR (Tabela 3).
Mutacje w domenie kinazy EGFR
Sekwencjonowaliśmy domenę kinazy EGFR w glejakach z 26 pacjentów. Jakość DNA była wystarczająca, aby umożliwić nam sekwencjonowanie całej domeny kinazy EGFR (egzony 18 do 24) u sześciu z siedmiu pacjentów z samą odpowiedzią i eksonu 21 w Pacjentem 6. Nie wykryto mutacji u siedmiu pacjentów z odpowiedź lub u ośmiu pacjentów bez odpowiedzi, dla których DNA było dostępne do sekwencjonowania (Tabela 2). Zatem jest mało prawdopodobne, aby mutacje w domenie kinazy EGFR określały wrażliwość glejaków na inhibitory kinazy EGFR. Zsekwencjonowaliśmy również domenę kinazy Her2 / neu i nie znaleźliśmy mutacji.
Amplifikacja genu EGFR
FISH wykazał – i potwierdził PCR w czasie rzeczywistym – że gen EGFR został zamplifikowany w 12 z 25 glejaków (48 procent); 7 z tych 12 wykazało polisomię
[podobne: amiodaron, ambroksol, diklofenak ]
[przypisy: weterynarz szczecin 24h, jak wygląda półpasiec zdjęcia, przeglądarka skierowań na leczenie nfz ]
