Ponadto do komórek połączonych dodawano panel kontrolny kontroli jakości od 10 bezobjawowych zainfekowanych dawców w rozcieńczeniu od do 50 i analizowano równolegle przez hodowlę i PCR. Wykrywanie HIV-1 metodą PCR
Etapy przygotowania, amplifikacji i hybrydyzacji oraz detekcji DNA zostały rozdzielone fizycznie, a odczynniki zostały przygotowane i wykorzystane w sposób zaprojektowany tak, aby zminimalizować egzogenne zanieczyszczenie i przeniesienie DNA.18 Procedury przygotowywania lizatu, tworzenie swoistych dla wirusa HIV systemy starterów i sond oligonukleotydowych, amplifikacja PCR oraz hybrydyzacja i wykrywanie oligomerów były modyfikacjami opisanych przez Kellogg i Kwok.16 Podwielokrotności PBMC w roztworze PCR A były rozmrażane co tydzień i mieszane z równą objętością roztworu PCR B (10 mM TRIS kwas solny [pH 8,3], 2,5 mM chlorek magnezu, procent Tween-20 i procent NP-40 zawierający 120 .g świeżo dodanej proteinazy K na mililitr), zlizowano w temperaturze 60 ° C przez godzinę, reakcję zgaszono w 95 ° C przez 10 minut, a następnie przechowywany w -20 ° C. Dla każdej próbki amplifikowano objętość lizatu odpowiadającą PBMC 2,5xl05 w 100 .l reakcji zawierającej 2 jednostki polimerazy DNA Amplitaq (Perkin-Elmer, Norwalk, Conn.), 50 mM chlorek potasu, 10 mM TRIS-chlorowodór kwas (pH 8,3), 0,005% żelatyny, 2,2 mM chlorku magnezu, 0,25% Tween-20, 0,25% NP-40 i 0,2 mM każdego trifosforanu deoksynukleotydu. Namnażanie DNA HIV-1 osiągnięto za pomocą 50 pmoli każdego startera gag HIV-1 (SK38 i SK39) 16 i 30 cykli denaturacji (95 ° C, 30 sekund), wyżarzania (55 ° C, 30 sekund) i wydłużania startera (72 ° C, 60 sekund), a następnie 10 minut w temperaturze 72 ° C w zautomatyzowanym bloku cieplnym z cyklem cieplnym (Perkin-Elmer). Amplifikowane sekwencje wykryto przez hybrydyzację w roztworze z sondą SK19 o wysokiej specyficznej aktywności (3 do 6 Ci na mikromol) znakowaną 32P, a następnie elektroforezę na 10% żelach poliakryloamidowych i autoradiografię.16 W tym samym czasie, co ocena dla wirusa HIV. prowirusowe sekwencje, lizaty zostały wewnętrznie przebadane pod kątem kompetencji PCR przez atenuowaną koamplifikację19, 20 pojedynczego kopii HLA-DQ-alfa genu ze starterami GH26 i GH27 i sondą GH64. 211 Początkowe testowanie PCR przeprowadzono w pojedynczej podwielokrotności. Jeśli wynik był dodatni, drugi zestaw reakcji przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Jeśli dwie lub więcej z tych czterech reakcji było dodatnich, początkowa próbka była uważana za wielokrotnie reaktywną. Dla wszystkich wielokrotnie reaktywnych próbek, podwielokrotną próbkę PCR testowano z użyciem podobnego algorytmu i drugiej pary primerów gag HIV-1 (SK145 i SK101), w połączeniu z sondą SK102.22. W każdym PCR, preparaty kontroli pozytywnej i negatywnej były zawarte na każdym etapie. Stwierdzono, że wskaźniki wyników fałszywie ujemnych i fałszywie dodatnich z powtórzonymi testami lizatów kontrolnych kompetycyjnych względem PCR wynosiły odpowiednio 0 (n = 55) i 4 procent (n = 175). 21 Ocenialiśmy czułość testu PCR co tydzień równolegle z każdym rutynowym stresem próbki, testując podwielokrotności rozcieńczeń 1:50 PBMC od seropozytywnego dawcy w komórkach odżywczych. Panel kontrolny jakości zawierający świeże PBMC pochodzące od 10 osób seropozytywnych oceniano również w rozcieńczeniu 1:50 w połączonych komórkach od dawców.
Analiza statystyczna
Szacunki i granice ufności prawdopodobieństwa oparto na modelach dwumianowych dla danych zliczających
[więcej w: kalipoz prolongatum, wykaz bezpłatnych leków dla seniorów, symnatal pro baby ]
